Kullanıcı Değerlendirmesi: / 6
ZayıfMükemmel 

Gen Klonlama Basamakları

1. Gen kaynağının izolasyonu
2. Genin bulunduğu bölgenin saptanması
3. Genin gen kaynağından çıkarılması
4. Transfer işleminde kullanılacak uygun vektör yapısının seçilmesi
5. Gen ile vektörün birleştirilerek rekombinanat DNA yapısının oluşturulması
6. Transformasyon yöntemi ile rekombinant DNA'nın alıcı organizmaya aktarılması
7. Transforme olmuş hücrenin kültür ortamından seçilmesi
8. Gen ürününün analizi.

1)Gen kaynağının izolasyonu

Klonlama çalışmalarında kullanılacak gen kaynakları kromozonal  DNA yapısı ,plazmit  DNA’sı ,faj veya virüs Nükleik Asitler,i messenger RNA , mitokondri ve kloroplast DNA’sı ve saf bir protein olabilir.

Plazmit DNA izolasyonu:

1. derecede önemli olan uygulama kromozonal DNA kirliliğinin ortadan kaldırılmasıdır.

1. İzolasyon işleme başlatıldığında hücre içindeki plazmitin uygun antibiyotik kullanılarak aktif duruma getirilmesi ve sonra sayısının arttırılması işlemi gerçekleştirilir.
2. Yeterli plazmit sayısına ulaşıldığında hücrelerin patlatılabilmesi için kaynatma , alkol ,lizi ,enzimatik parçalama ve SDS ile parçalama gibi değişik tekniklerden herhangi birisi tercih edilir. Kromozom DNA kirliliğini en aza indirmek veya tamamen yok etmek için bu teknikler içinde tercih edilecek yöntem alkali  lizi ile birlikte kaynatma işleminin uygulanmasıdır.
3. Patlatılmış yapılar sentrifüj işlemiyle çöktürülerek  DNA ve diğer yapıların bir birinden ayrılması sağlanır .Altta kalan çökelti içinde kromozonal DNA parçaları , hücre duvarı ve hücre zarına ait kalıntılar ve büyük moleküllü proteinler yer alırken , üsteki sıvı faz plazmit DNA’sını ve küçük moleküller ağırlığa sahip proteinleri içerir.
4. Sıvı faz yeni bir tüpe aktarılarak sentrifüjde çökmeyen proteinlerin ortamdan uzaklaştırıla bilmesi için fenol kloroform uygulamasına geçilir.Uygulama sırasında örnekle kullanılacak  fenol kloroform eşit hacimde olmalıdır.
5. Sentrifüj işlemi sonucunda tüpün içinde 3 farklı tabakalanma meydana gelir .En altta fenol ve kloroformdan oluşan organik faz ,bunun üzerinde presibite olmuş beyaz renkli protein tabakası , en üstte ise plazmit DNA sıvı içeren sıvı faz yer alır.En üsteki sıvı faz yeterince şeffaf ise fenol kloroform uygulamasına son verilir.
6. Bulanıklık varsa bir kez daha ferol kloroform uygulanılır.
7. Plazmit DNA’sının olduğu düşünülen sıvı faz yeni bir hücre aktarılır.Ve sentrifüj edilerek 2 fazın oluşması sağlanır. Kullanılan kloroform bir yandan ferolü ortamdan uzaklaştırırken aynı zamanda ortamda bulunabilecek proteinleride çöktürür.İzoamilalkol ise kloroform ile DNA fazlarının birbirinden ayrılmasını sağlar.

2)Genin bulunduğu yerin saptanması

1. Gen kaynağı üzerinde klorlanmak istenen genin,genomun neresinden olduğunu bulabilmek için değişik uygulamalardan yararlanılır.
2. Bunlar invitro sentez ve hipridizasyon yöntemleridir.İnvitro sentez olayında ;son ürün proteinden yola çıkılır.Ve tamamen invitro koşullardan mRNA sentezi gerçekleştirilerek tek iplik şekline dönüştürülen DNA ile birleştiği nokta klonlanmak istenen gen bölgesi şeklinde saptanır.Hipridizasyonda ;temel prensip 2 tek iplikli yapının eşleştirilmesidir.Uygunalacak olan teknikler gen kaynağının özelliğine göre farklı şekilde adlandırılır .Bunlar southern hipridizasyon ve Norther hipridizasyondur.

3)Genin gen kaynağından çıkarılması

Gen kaynağından genin çıkarılabilmesi için kesici enzimlerden yaralanılır.ECOR I , BamHl,Pst-l ,Hint-III gibi endolükleoz enzimleridir.

4)Uygun vektörün seçimi

1. Klonlama amacı ile kullanılacak olan vektörler hiçbir zaman doğal yada faz DNA’ları değildirler.Bunun yerine invitro koşullarda değişikliğe uğratılmaz genetik yapısı bilinen  plazmit ve fazlardan yararlanılır.Örneğin en fazla tercih edilen vektörler arasında pBR322 plazmit vektörü vardır.
2. Kullanılacak vektörlerde bazı özellikler olmalıdır . Bunlar ;vektörler üzerinde en az 2 antibiyotik dirençlilik geni bulunmaktadır.Vektör enzimle kesildiği zaman sadece bir noktadan kesilmeli ve kesim bölgesi dirençlilik genlerinden biri olmalıdır.Enzimlerle kesildiği zaman herhangi bir parça kaybı olmamalıdır .

5)Rekoubinant DNA’nın oluşturulması

1. Aynı enzimle kesilen vektör ve gen kaynağından oluşan parçalar aynı ortama konularak 37ºC de 5 dk.süreyle inkibasyona bırakılır.
2. Bileşmenin sağlana bilmesi için ortamda DNA ligaz enzimi bulunmalıdır.
3. İnkübasyon sonunda istenilen genin yer aldığı rekoubinant DNA oluşabileceği gibi resirkülasyon gerçekleşebilir. Veya başka genleri içeren parçaların bulunduğu rekoubinant yapılar meydana gelebilir.

6)Rekombinant yapının aktarılması

Transformasyon aşamasında en fazla dikkat edilmesi  gereken nokta alıcı organizmaların vektördeki dirençliliği sağlayan genler açısından hassas durumunda  olmasıdır.
Transformasyon yapılacak olan hücre compotence duruma getirilir. Rekombinant DNA ile compotence hücre Ca’nın bulunduğu bir çözelti içerisinde birleştirilecek rekombinant yapının alıcı hücreye geçmesi sağlanır .
Transformasyon olayından sonra transforme olmuş hücrelerde değişik oluşumlarla karşılaşmak mümkündür.

7)Transforme olmuş hücrelerin  seçilmesi

Bu işlem için vektör üzerinde bulunan dirençlilikle ilgili antibiyotiklerin bulunduğu katı besiyerleri kullanılır . Besiyerlerinde  4 farklı durumla karşılaşmak mümkündür.

1. Her iki antibiyotikli besiyerinde hiç üreme meydana gelmez.
2. Her iki antibiyotikli besiyerinde  üreme vardır.
3. Antibiyotikli besiyerinden birisinde üreme vardır , fakat transforme olan hücreler aranılan özellikleri taşımaz.
4. Antibiyotikli besiyerlerinden sadece 1 ‘inde üreme vardır ve istenilen özellikteki organizmalar yer alır.

8)Gen ürününün kontrolü

Uygun transformat hücrelerden içerisinde gen ürününün oluşabileceği substrat bulunan sıvı besiyerlerinde üretilir. Gen ürünü sıvı besiyerlerinden izole edilerek sıvılaştırma işlemi uygulanır.Bakteri musmusculus ,sıçan ve tavşan gibi hayvan deneyleri ile toksisite ve allerjik testi yapılır.
Kullanılabilir doz ayarlamasından sonra amaca uygun olarak kullanılır.