PCR yöntemi ve bu yöntem ile virolojik hastalıkların nasıl tespit edildiği hakkında neler biliyoruz?
Yada bu konu hakkında ne bilgimiz var. LÜtfen burada paylaşalım...

PCR (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU)

Laboratuvar ortamında spesifik DNA dizilerinin ;primer denilen sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla çoğaltılması işlemidir
Standart bir PCR Protokolü yoktur. Bileşenler çoğaltılacak DNA bölgesinin özelliklerine göre değişir.


KLASİK PCR: Hedef DNA dizisinin her iki ucuna özgü spesifik primerler kullanılarak termostabil DNA polimeraz yardımıyla uygulanan PCR çeşididir.Daha sonraki analizler için döngü sayısına göre üstel oranda artan düzeyde ürün elde edilir.Tipik bir PCR üç temel basamakta gerçekleşir:

*Denatürasyon:İlk aşamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayrılır(denatürasyon) .Çoğunlukla 94°C- 97°C arasında 15-60 sn süresince uygulanır.(İlk denatürasyon tek saykıl olarak 15 dakikaya kadar uygulanır)

*Annealing(Bağlanma):Denatürasyonu takiben daha düşük ısılarda oligonükleotid primerler, ayrılmış olan tek zincirli DNA üzerinde kendi eşlenikleri olan bölgelere bağlanırlar.Bu olay çoğunlukla 47°C- 60°C arasında 30-60 sn ‘de gerçekleşir.(G/C oranı yüksek olan bölgelerde bağlanma ısısı 68°C’ye kadar arttırılabilir)

*Elongasyon(uzama):Son aşamada ısı 72°C’ye kadar arttırılarak DNA polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır.Elongasyon basamağının süresi kullanılan polimerazın cinsine ve amplifiye edilecek DNA‘nın uzunluğuna göre 30sn ile 3 dakika arasında değişir.

Termal sayklırın bu üç basamağı her tekrarında DNA miktarı teorik olarak iki katına çıkar.Oluşan ürün; ilk koyulan DNA miktarı ve saykıl sayısına bağlıdır. 25-40 saykıl uygulanır.

Klasik PCR normalde sayısal (quantitatif) bir değerlendirme ölçüsü değildir fakat quantitatife dönüştürülür.Jel elektroforez de ürünler karşılaştırılarak veya most probable number (MPN) yardımıyla sonuca ulaşılır.MNP yönteminde ardarda seyreltmeler ve MNP hesaplayıcısı kullanılır. Tercih edilmeyen bir yöntemdir.Bir diğer yöntem de competitive (karşılaştırmalı) PCR’dir. Karşılaştırmada delesyon veya insersiyon taşıyan örneklerle (farklı uzunlukta bant oluştururlar) elde edilen ürün jel elektroforezde karşılaştırılır.

MULTİPLEX PCR: Klasik veya Real-time PCR’nin modifikasyonuyla iki veya daha fazla farklı PCR amplifikasyonunun aynı reaksiyonda gercekleştirilmesine dayanır.Klasik PCR ile aynı basamaklarda gerçekleşir fakat her bir reaksiyonda çoklu primer setleri kullanılır.Multiplex PCR ile daha az zamanda daha çok hedef bölge amplifikasyonu gerçekleştirildiğinden kullanışlı bir inceleme yöntemidir.Fakat önemli derecede optimizasyon gerektirir.Değişik hedeflerin aynı reaksiyon şartlarında amplifikasyonunu sağlamak için kullanılacak primerlerin dikkatli seçilmesi ,annealing ısılarının birbirine uygun olması, birbirleriyle dimerizasyona girmemeleri gibi bazı önemli şartları gerçekleştirilmesi gereklidir.Farklı primer çiftlerinin en iyi konsantrasyonlarının seçimi ve non spesifik amplifikasyonların önlenmesi birçok deneme gerektirir.

Reverse Transcription (RT)-PCR: mRNA ve viral RNA gibi RNA hedef dizilerinin amplifikasyonu amacıyla kullanılır.Bu PCR çeşidinde bir reverse transkriptaz enzimi ve DNA primeri kullanılır.DNA primeri genellikle dT oligonükleotidi içerir ( sadece hexamer yapıda thymidine nükleotidi) veya bir spesifik primerdir.dT messenger RNA’ nın poli A kuyruğuna bağlanır ( 5’ ucunda). dT hexameri tüm RNA çeşitlerinde bulunmakla birlikte dezavantajı 25°C de hibridize olması ve ortamda RNase inhibitörü bulunmaz ise çabuk bozunmasıdır.

Reverse transcription ve PCR amplifikasyonu bir veya iki aşamada uygulanabilir.Ayrı ayrı iki aşama halinde uygulanan RT-PCR daha hassas ; tek aşamalı ise daha az kontaminasyon riski taşır ( çünkü tüp transkripsiyondan sonra açılmamaktadır).Hangi yöntemin kullanılacağının belirlenmesi bizim hassasiyetmi yoksa kontaminasyondan kaçınmakmı istediğimize bağlıdır.RT-PCR için birkaç çeşit reverse transcriptase enzimi vardır.Bir veya iki aşamalı reaksiyon seçimi ve daha sonraki aplikasyonlara göre enzim karekteristiği seçilir.Bu seçimde RNase aktivitesinin olup olmaması , iyon gerekliliği,dUTP ekleyebilme yeteneği ve optimum çalışma ısısı gibi etmenlerde önemlidir.

NESTED PCR: Komplex mikrobiyal popülasyonlara ait hedef dizilerin spesifik bir şekilde amplifikasyonu klasik PCR yöntemleriyle bazen mümkün olmayabilir.Eğer amplifikasyonunu yapmaya çalıştığımız fragment uzunluğunda non-spesifik fragment(ler) amplifiye olmuş ise bu bizi yanlış sonuca götürebilir.Bundan kaçınmak için Nested PCR yöntemleri uygulanır.Bu metod ; klasik PCR’ye farklı primer takımlarıyla ikinci bir amplifikasyon uygulamaktan ibarettir.İlk amplifikasyonda elde edilen ürün ikinci PCR için kalıp olarak kullanılır.Kullanılan ikinci primer takımı diziye özgüdür.  

KULLANILAN ENZİMLER: Termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus’ dan elde edilen Taq DNA polymeraz ve modifikasyonları neredeyse tüm DNA amplifikasyonlarında kullanılır.Diğer DNA polimerazlar da birbirlerinden nükleotid ekleme hızları, yarılanma ömürleri, ısı tolerans farklılıkları, eksonükleaz özelliklerinin olup olmaması gibi yönleriyle ayrılırlar.Hot-start DNA polimeraz enzimleri non-spesifik ürün oluşumunu engellemesi, yüksek ısılara dayanabilmesi, düşük annealing ısılarında da çalışabilmesi gibi nedenlerle tercih edilmektedir.

Enzim tipinin seçimini yapılacak amplifikasyonun koşulları belirler.Bir tek enzim kullanıldığı gibi kombinasyon da oluşturulabilir.

PCR'ı anlatan güzel bir klip:) (The PCR Song)

Klip indirme linki: http://bio-rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/biorad_pcrsong.mov.zip

Sözleri:http://bio-rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/BioRad_PCRsong_Lyrics.pdf